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                          格慧泰福(GHTF) | 高端醫療器械臨床注冊專家

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                          北京市醫療器械無菌試驗檢查要點指南(2010版)
                           無菌檢驗是無菌醫療器械產品生產控制過程中的一項重要內容。其檢驗方法、檢驗結果判定及檢驗人員業務能力等因素直接影響產品的質量和安全。作為無菌醫療器械生產企業,其無菌檢驗工作應由本企業獨立完成。

                            本指南旨在幫助北京市醫療器械生產監管人員增強對無菌檢驗相關知識的認識,指導和規范全市醫療器械生產監管人員對醫療器械生產企業無菌檢驗過程控制水平的監督檢查工作,同時,為醫療器械生產企業(以下簡稱生產企業)在無菌檢驗的過程管理要求提供參考和依據。

                            當國家相關法規、標準、檢查要求發生變化時,應重新修訂本指南。

                            一、適用范圍

                            本指南適用于北京市藥品監督管理局組織、實施的《醫療器械生產企業許可證》核發、變更、換證等現場檢查、醫療器械質量管理體系考核、醫療器械生產質量管理規范檢查、醫療器械生產日常監督等各項涉無菌檢驗的檢查。

                            二、檢查內容

                            檢查人員應在充分了解生產企業無菌檢驗活動的情況下,對其無菌檢驗過程的控制水平進行客觀的檢查和評價。

                            一般情況下,檢查人員可按照以下順序開展檢查工作,并適時做好相關記錄:

                            1、了解產品特性及生產企業選擇的無菌檢驗方法。常見的產品無菌檢查法包括直接接種法和薄膜過濾法。當建立產品的無菌檢查方法時,生產企業應進行方法的驗證,以證明所采用的方法能夠給出正確的結果。若該產品的組分或原檢驗條件發生改變時,檢查方法應重新驗證。驗證時,應按供試品無菌檢查的規定及有關要求進行操作。對藥典規定的每一試驗菌應逐一進行驗證。驗證試驗也可與供試品的無菌檢查同時進行。

                            2、了解檢驗人員的專業背景、培訓情況及工作經歷??赏ㄟ^查看學歷證書、培訓證書或當面詢問檢驗人員的方式,檢查無菌檢驗人員是否具備微生物專業知識,并經過無菌技術的培訓。

                            3、現場察看無菌實驗室。無菌檢查應在環境潔凈度10000 級下的局部潔凈度 100 級的單向流空氣區域內(如在萬級潔凈間內配置超凈工作臺等)中進行,其全過程必須嚴格遵守無菌操作,防止微生物污染。單向流空氣區、工作臺面及環境應定期監測。

                            4、現場察看無菌試驗所需的設備和器具。其中,

                            主要設備包括:恒溫培養箱(真菌、細菌)、恒溫水浴箱、壓力蒸汽滅菌器、電熱干燥箱、電子天平、光學顯微鏡、集菌儀、過濾裝置(無油真空泵、濾杯、濾頭、濾瓶、微孔濾膜、夾子)等;(從試驗安全性考慮,建議陽性對照試驗使用生物安全柜)

                            主要器具有:試管及試管架、酒精燈、75%乙醇棉、滅菌刻度吸管(1ml)、滅菌平皿(9cm)、錐形瓶、三角燒瓶、滅菌剪刀、鑷子等。

                            生產企業應采用可靠方法對與供試液接觸的所有器具滅菌,通常置壓力蒸汽滅菌器內121℃30分鐘,或置電熱干燥箱內160℃2小時。器具滅菌后必須做好標識,標明滅菌的時間和使用有效期。器皿在滅菌后,最多1周即用完。檢查時還應注意清點培養皿的個數,與試驗記錄中反映的培養基個數是否一致。

                            5、對照生產企業有關無菌試驗的管理制度、操作規程等相關技術文件,要求檢驗人員當場操作或口述無菌檢驗的過程。

                           ?。?)培養基制備

                            生產企業可按藥典中的處方制備培養基,亦可使用按該處方生產的符合規定的脫水培養基。配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養基應保存在2℃~25℃、避光的環境,若保存于非密閉容器中,一般在3周內使用;若保存于密閉容器中,一般可在1年內使用。

                            無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基等應符合培養基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。

                           ?。?)供試品的無菌檢查

                            無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許,應采用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應與驗證的方法相同。無菌試驗過程中,若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑,應證明其有效性,且對微生物無毒性。

                            無菌操作時,對供試品容器表面應用適宜的消毒液進行徹底消毒,如果供試品容器內有一定的真空度,可用適宜的無菌器材(如帶有除菌過濾器的針頭)向容器內導入無菌空氣,再按無菌操作起開容器取出內容物。

                           ?。?)培養及觀察

                            含培養基的容器按規定的溫度培養14天。培養期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后、或在培養過程中,培養基出現渾濁,培養14天后,不能從外觀上判斷有無微生物生長,可取該培養液適量轉種至同種新鮮培養基中,細菌培養2天、真菌培養3天,觀察接種的同種新鮮培養基是否再出現渾濁;或取培養液涂片,染色,鏡檢,判斷是否有菌。

                            在觀察試驗結果的過程中,還應考慮假陰性的影響。其中影響假陰性發生的因素有:培養條件不能支持微生物的生長(促生長試驗);在無菌試驗中,產品中釋放出了殺菌或微生物電解的物質(消除抑菌物質);從滅菌處理到培養有一定的時間間隔(確定滅菌后產品的儲存條件及儲存時間)。

                           ?。?)結果判斷

                            生產企業應按照如下標準進行判斷:

                           ?、偃艄┰嚻饭芫吻?,或雖顯渾濁但經確證無菌生長,判供試品符合規定;②若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長,判供試品不符合規定,除非能充分證明試驗結果無效,即生長的微生物非供試品所含。陽性對照管應生長良好,陰性對照管不得有菌生長,否則試驗無效。

                            當符合下列至少一個條件時,方可判試驗結果無效:①無菌檢查試驗所用的設備及環境的微生物監控結果不符合無菌檢查法的要求;②回顧無菌試驗過程,發現有可能引起微生物污染的因素;③供試品管中生長的微生物經鑒定后,確證是因無菌試驗中所使用的物品和(或)無菌操作技術不當引起的。

                          試驗若經確認無效,應重試。重試時,重新取同量供試品,依法重試,若無菌生長,判供試品符合規定;若有菌生長,判供試品不符合規定。

                            6、查閱試驗記錄。完整的試驗記錄應明確包含下列幾類信息:

                           ?。?)樣品記錄,至少應包括:取樣日期、樣品名稱、樣品規格、樣品批號、取樣地點、取樣方式、取樣人、原始試驗記錄序號。

                           ?。?)滅菌物品制作記錄

                           ?、倥囵B基:培養基名稱、培養基批號、培養基用量(g)、蒸餾水用量(ml)、培養基分裝數量、滅菌日期、滅菌的實際溫度和壓力、滅菌時間、制作人、培養基存放地點和有效期等。

                           ?、谄骶撸浩骶呙Q、器具數量、滅菌日期、滅菌的實際溫度和壓力、滅菌時間、制作人、器具存放地點、有效期等。

                           ?。?)原始試驗記錄,至少應包括:記錄名稱、記錄序號、樣品名稱、樣品唯一性標識(例如:樣品號)、樣品規格、樣品批號、滅菌批號、樣品數量、取樣日期、檢驗日期、檢驗依據、主要試驗設備及器具、試驗方法、試驗環境條件、試驗結果(每日觀察的結果)、試驗結論、檢測人、復核人等。

                           ?。?)廢棄物處理記錄,至少應包括:廢棄物形態(固體、液體)、廢棄物數量、滅菌時間和壓力、經辦人、處理日期等。

                            三、其它應注意的問題

                            1、生產企業應確保樣品具有代表性:試驗樣品應從常規產品中能夠代表加工過程和條件的批中選擇。選擇樣品是隨機的。試驗樣品的選擇和處理技術應明確,以免對樣品上所含的微生物的數量和種類造成污染和改變。試驗樣品可以選擇制造過程中的不合格產品,它們應該代表這個生產批的加工程序和條件。用于試驗的不合格產品應不會影響無菌測試的有效性。

                            2、生產企業對于供試品的選取、轉移過程要采取防止污染措施,確保試驗結果的可靠性。選取制作供試品的試驗樣品時,樣品包裝須完好無損,尤其是只有一層包裝的樣品。進入無菌檢驗室的樣品若有兩層(或兩層以上)包裝的,需將外包裝在傳遞窗(或緩沖間)拆除后,傳入實驗室。

                            3、無菌檢驗中接觸供試品的試驗用具溫度不能過高以防可能存在的菌被燙死。對不同種類和不同批次的產品,在拆包裝及夾取樣品時,應更換試驗用具(如:剪刀、鑷子)。

                            4、進入無菌操作室的所有培養基、供試品等的外表都應采用適用的方法進行消毒處理(如:紫外燈照射不少于30分鐘),以避免將外包裝污染的微生物帶入無菌檢驗室。出具試驗結果后,所有培養物須經121℃高壓滅菌30分鐘的處理。

                            5、由于無菌檢驗時間跨度較長,因此過程的記錄應能夠完整體現試驗的全過程,對于在試驗過程中出現的各種情況,均應在記錄中客觀反映。
                            參考資料一:

                            常見的名詞解釋

                            1、滅菌:殺滅或除去特定環境或物品中一切微生物的過程。目前國際上規定,滅菌過程必須使滅菌物品污染的微生物存活率減少到10-6及以下。

                            2、微生物:在顯微鏡下才能看到的微小實體,包括細菌、真菌、原生動物和病毒。

                            3、無菌技術:是指在微生物試驗工作中,控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關措施,其中包括無菌環境設施、無菌試驗器材以及無菌操作。

                            4、無菌操作:是指在無菌環境條件下,在對無菌制品或無菌器械進行檢驗的過程中,能防止微生物污染與干擾的一種常規操作方法。

                            5、培養條件:用于促進微生物發育、生長和繁殖的生長培養基和培養方式的組合。

                            6、需氧菌:在代謝中,有氧條件下才能生存的微生物。

                            7、厭氧菌:在代謝中,沒有氧的條件下才能生存的微生物。

                            8、抑細菌/抑霉菌試驗:用選定的微生物來演示某些物質的存在能夠抑制這些微生物的繁殖。

                            9、促生長試驗:用于證明生長培養基能夠支持微生物生長的技術操作。

                            10、假陰性:實際陽性的無菌試驗結果被變成了陰性。

                            11、假陽性:實際陰性的無菌試驗結果被變成了陽性。

                            12、生物指示物:對特定滅菌工藝有確定的抗力,可供使用的微生物檢驗器材。

                            13、化學指示物:根據暴露于某種滅菌工藝所產生的化學或物理變化,在一個或多個預定工藝參數上顯示變化的指示器材。

                            14、無菌保證水平(SAL):滅菌后產品上存在單個活微生物的概率。

                            參考資料二:

                            無菌室空氣中菌落數的檢查

                            無菌室在消毒處理完畢后,應檢查空氣中的菌落數。方法如下:取直徑約90mm培養皿,無菌操作注入融化的營養瓊脂培養基約20mL,在30℃~35℃培養48小時證明無菌后,取3只培養皿在無菌室操作臺或超凈工作臺平均位置打開上蓋,暴露30分鐘后蓋好,置30℃~35℃培養48小時后取出檢查,3只雙碟上生長的菌落數平均不得超過1個。無菌試驗過程中應檢查空氣中的菌落數,方法同上。在試驗開始進行時打開平皿蓋,至試驗結束蓋好照上法培養,應符合上述要求。

                            參考資料三:

                            供試品數量的選擇

                            檢驗數量是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數量。除另有規定外,出廠產品按藥典附錄ⅩⅢ B中表1規定;上市產品監督檢驗按表2、表3規定。表1、表2、表3中最少檢驗數量不包括陽性對照試驗的供試品用量。一般情況下,供試品無菌檢查若采用薄膜過濾法,應增加1/2的最小檢驗數量作陽性對照用;若采用直接接種法,應增加供試品1 支(或瓶)作陽性對照用。執行GB/T14233.2的供試品數量應滿足同一批號3~11個單位供試品。

                            檢驗量是指一次試驗所用的供試品總量(g或ml)。除另有規定外,每份培養基接種的供試品量按表2、表3規定。若每支(瓶)供試品的裝量按規定足夠接種兩份培養基,則應分別接種硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基。采用薄膜過濾法時,檢驗量應不少于直接接種法的總接種量,只要供試品特性允許,應將所有容器內的全部內容物過濾。

                          表1 批出廠產品最少量檢驗數量

                          供試品

                          批產量N(個)

                          每種培養基最少檢驗數量

                          注射劑

                          大體積注射劑(>100ml)

                          ≤100

                          100<N≤500

                          >500

                          10%或4個(取較多者)

                          10個

                          2%或20個(取較少者)

                          2%或10個(取較少者)

                          眼用及其他非注射產品

                          ≤200

                          >200

                          5%或2個(取較多者)

                          10個

                          桶裝固體原料

                          ≤4

                          4<N≤50

                          >50

                          每個容器

                          20%或4個容器(取較多者)

                          2%或10個容器(取較多者)

                          醫療器具

                          10≤100

                          100<N≤500

                          >500

                          10%或4 件(取較多者)

                          10 件

                          2%或20 件(取較少者)

                            注:若每個容器中的裝量不足接種兩種培養基,那么表中的檢驗數量應加倍

                          表2 上市抽驗樣品(液體制劑)的最少檢驗量

                          供試品量V

                          (ml)

                          每支樣品接入每管培養基的最少樣品量

                          最少檢驗數量

                          (瓶或支)

                          ≤1

                          1<V<5

                          5≤V<20

                          20≤V<50

                          50≤V<100

                          50≤V<100(靜脈給藥)

                          100≤V≤500

                          V>500

                          全量

                          半量

                          2ml

                          5ml

                          10ml

                          半量

                          半量

                          500ml

                          20①

                          10

                          10

                          10

                          10

                          10

                          6

                          6

                          ①每種培養基各接種10支供試品.

                          表3 上市抽驗樣品(固體制劑)的最少檢驗量

                          供試品裝量M

                          (瓶或支)

                          每支樣品接入每管培養基的最少樣品量

                          最少檢驗數量

                          (瓶或支)

                          M<50mg

                          50mg≤M<300mg

                          300mg≤M<5g

                          M≥5g

                          一次性使用含藥產品

                          全量

                          半量

                          150mg

                          500mg

                          整個產品

                          20①

                          10

                          10

                          10

                          10

                           ?、倜糠N培養基各接種10支供試品

                           ?、谕把b固體原料的最少檢驗數量為4個包裝


                            參考資料四:

                            培養基的制備

                            培養應注意培養條件:硫乙醇酸鹽流體培養基 30~35℃14天;改良馬丁培養基 23~28℃14天。選擇培養條件需考慮的因素:產品的性質、制造方法、潛在的微生物污染來源、可能遇到的微生物種類。硫乙醇酸鹽流體培養基必須在煮沸后,再進行分裝、滅菌。

                            1、硫乙醇酸鹽流體培養基

                            酪胨 (胰酶水解) 15.0g、酵母浸出粉 5.0g、葡萄糖 5.0g、氯化鈉 2.5g、L-胱氨酸 0.5g、新配制的0.1%刃天青溶液 1.0 ml、硫乙醇酸鈉 0.5g(或硫乙醇酸 0.3ml)、瓊脂 0.75g、水 1000 ml

                            除葡萄糖和刃天青溶液外,取上述成分混合,微溫溶解,調節 pH 為弱堿性,煮沸,濾清,加入葡萄糖和刃天青溶液,搖勻,調節 pH 值使滅菌后為 7.1±0.2。分裝至適宜的容器中,其裝量與容器高度的比例應符合培養結束后培養基氧化層(粉紅色)不超過培養基深度的 1/2。滅菌。在供試品接種前,培養基氧化層的高度不得超過培養基深度的 1/5 ,否則,須經 100 ℃水浴加熱至粉紅色消失(不超過 20 分鐘),迅速冷卻,只限加熱一次,并防止被污染。

                          硫乙醇酸鹽流體培養基置 30℃~35℃培養。

                            2、改良馬丁培養基

                            胨 5.0g、磷酸氫二鉀 1.0g、酵母浸出粉 2.0g、硫酸鎂 0.5g、葡萄糖 20.0g、水 1000 ml

                           除葡萄糖外,取上述成分混合,微溫溶解,調節pH值約為6.8,煮沸,加入葡萄糖溶解后,搖勻,濾清,調節pH值使滅菌后為6.4±0.2,分裝,滅菌。

                          改良馬丁培養基置 23℃~28℃培養。

                            3、選擇性培養基

                            按上述硫乙醇酸鹽流體培養基或改良馬丁培養基的處方及制法,在培養基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑,其用量同驗證試驗。

                            4、營養肉湯培養基

                            胨 10.0g、氯化鈉 5.0g、牛肉浸出粉 3.0g、水 1000 ml

                            取上述成分混合,微溫溶解,調節 pH 為弱堿性,煮沸,濾清,調節pH值使滅菌后為 7.2±0.2,分裝,滅菌。

                            5、營養瓊脂培養基

                            按上述營養肉湯培養基的處方及制法,加入14.0g瓊脂,調節pH 值使滅菌后為7.2±0.2,分裝,滅菌。

                            6、改良馬丁瓊脂培養基

                            按改良馬丁培養基的處方及制法,加入14.0g 瓊脂,調節pH值使滅菌后為6.4±0.2,分裝,滅菌。
                            參考資料五:

                            培養基的適用性檢查

                            1、無菌性檢查:每批培養基隨機取不少于5支(瓶),培養14天,應無菌生長。

                            2、靈敏度檢查

                            菌種:培養基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代),試驗用菌種應采用適宜的菌種保存技術進行保存,以保證試驗菌株的生物學特性。

                            金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕

                            銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕

                            枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)〔CMCC(B)63 501〕

                            生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕

                            白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕

                            黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕

                            3、菌液制備

                            接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上,接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中,30℃~35℃培養18小時~24小時;接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上,23~28℃培養24~48小時,上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數小于100cfu(菌落形成單位)的菌懸液。

                            接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上,23~28℃培養5~7天,加入3~5ml含0.05%(v/v)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫。然后,用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內,用含0.05%(v/v)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含孢子數小于100cfu的孢子懸液。

                            菌懸液在室溫下放置應在2小時內使用,若保存在2~8℃可在24小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2~8℃,在驗證過的貯存期內使用。

                            4、培養基接種

                            取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養基9支,分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支,另1支不接種作為空白對照,培養3天;取每管裝量為9ml的改良馬丁培養基5支,分別接種小于100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉各2支,另1支不接種作為空白對照,培養5天。逐日觀察結果。

                            5、結果判定

                            空白對照管應無菌生長,若加菌的培養基管均生長良好,判該培養基的靈敏度檢查符合規定。

                            參考資料六:

                            方法驗證試驗

                            1、菌種及菌液制備

                            除大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 4 4102〕外,金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培養基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。

                            2、薄膜過濾法

                            取每種培養基規定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾,沖洗,在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌,過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養基或改良馬丁培養基中,或將培養基加至濾筒內。另取一裝有同體積培養基的容器,加入等量試驗菌,作為對照。置規定溫度培養3~5天,各試驗菌同法操作。

                            3、直接接種法

                            取符合直接接種法培養基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養基8管,分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2管,取符合直接接種法培養基用量要求的改良馬丁培養基4管,分別接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培養基規定量的供試品量,另1管作為對照,按置規定的溫度培養3~5天。

                            4、結果判斷

                            與對照管比較,如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好,則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計,照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長,則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用,可采用增加沖洗量、增加培養基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法,消除供試品的抑菌作用,并重新進行方法驗證試驗。

                            參考資料七:

                            供試品處理及接種培養基

                            直接接種法:每個供試品按規定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基的容器中。除另有規定外,每個容器中培養基的用量應符合接種的供試品體積不得大于培養基體積的10%,同時,硫乙醇酸鹽流體培養基每管裝量不少于15ml,改良馬丁培養基每管裝量不少于10ml。

                            薄膜過濾法:將供試液混勻,過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑,須用適量的沖洗液沖洗濾膜,沖洗次數不得少于三次。沖洗后,如用封閉式薄膜過濾器,分別將100ml硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基加入相應的濾筒內。如采用一般薄膜過濾器,取出濾膜,將其剪成 3等份,分別置于含50ml 硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基的容器中,其中一份做陽性對照用。

                            薄膜過濾法應優先采用封閉式薄膜過濾器,也可使用一般薄膜過濾器。無菌檢查用的濾膜孔徑應不大于0.45μm。直徑約為50mm。根據供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質??股毓┰嚻窇x擇低吸附的濾器及濾膜。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。使用時,應保證濾膜在過濾前后的完整性。

                            參考資料八:

                            對照試驗

                            1、陽性對照:一般情況下,供試品無菌檢查若采用薄膜過濾法,應增加1/2的最小檢驗數量作陽性對照用;若采用直接接種法,應增加供試品無菌檢查時每個培養基容器接種的樣品量作陽性對照用。

                            陽性對照應根據供試品特性選擇陽性對照菌:無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品,以金黃色葡萄球菌為對照菌;抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌;抗厭氧菌的供試品,以生孢梭菌為對照菌;抗真菌的供試品,以白色念珠菌為對照菌。陽性對照試驗的菌液制備同方法驗證試驗,加菌量小于100cfu,供試品用量同供試品無菌檢查每份培養基接種的樣品量。陽性對照管培養48~72小時應生長良好。

                            2、陰性對照:供試品無菌檢查時,應取相應溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作,作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。

                            3、稀釋液、沖洗液及其制備方法

                            稀釋液、沖洗液配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。

                           ?。?)0.1%蛋白胨水溶液 取蛋白胨1.0g,加水1000ml,微溫溶解,濾清,調節pH值至7.1±0.2,分裝,滅菌。

                           ?。?)pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液取磷酸二氫鉀3.56g,磷酸氫二鈉7.23g,氯化鈉4.30g,蛋白胨1.0g,加水1000ml,微溫溶解,濾清,分裝,滅菌。

                           ?。?)根據供試品的特性,可選用其他經驗證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。

                            如需要,可在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。

                            參考資料九:

                            參考標準

                            ——《中華人民共和國藥典》

                            ——GB/T14233.2《醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 第2部分生物學試驗方法》

                            ——GB19489《實驗室 生物安全通用要求》

                            ——GB50346《生物安全實驗室建筑技術規范》

                            ——GB/T16292~16294《醫藥工業潔凈室(區)懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》

                            ——ISO11737-2《醫療器械的滅菌 微生物方法 第2部分:滅菌過程定義、驗證和保持中的無菌檢測》

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