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                          滅菌/無菌工藝驗證指導原則(征求意見稿)
                           

                          1概述

                          無菌藥品是指法定藥品標準中列有無菌檢查項目的制劑和原料藥,一般包括注射劑、無菌原料藥及滴眼劑等。從嚴格意義上講,無菌藥品應完全不含有任何活的微生物,但由于目前檢驗手段的局限性,絕對無菌的概念不能適用于對整批產品的無菌性評價,因此目前所使用的無菌概念,是概率意義上的無菌。一批藥品的無菌特性只能通過該批藥品中活微生物存在的概率低至某個可接受的水平,即無菌保證水平(Sterility Assurance Level, SAL)來表征。而這種概率意義上的無菌保證取決于合理且經過驗證的滅菌工藝過程、良好的無菌保證體系以及生產過程中嚴格的GMP管理。

                          無菌藥品通常的滅菌方式可分為:1)濕熱滅菌;2)干熱滅菌;3)輻射滅菌;4)氣體滅菌;5)除菌過濾。按工藝的不同分為最終滅菌工藝(sterilizing process)和無菌生產工藝(aseptic processing)。其中最終滅菌工藝系指將完成最終密封的產品進行適當滅菌的工藝,由此生產的無菌制劑稱為最終滅菌無菌藥品,濕熱滅菌和輻射滅菌均屬于此范疇。無菌生產工藝系指在無菌環境條件下,通過無菌操作來生產無菌藥品的方法,除菌過濾和無菌生產均屬于無菌生產工藝。部分或全部工序采用無菌生產工藝的藥品稱為非最終滅菌無菌藥品?;跓o菌藥品滅菌/除菌生產工藝的現狀,本指導原則主要對在注射劑與無菌原料藥的生產中比較常用的濕熱滅菌與無菌生產工藝進行討論。本指導原則中的濕熱滅菌工藝驗證主要包括滅菌條件的篩選和研究,濕熱滅菌的物理確認,生物指示劑確認等內容;無菌生產工藝驗證主要包括無菌分裝、除菌過濾、培養基模擬灌裝、過濾系統的驗證等驗證內容。

                          最終滅菌工藝和無菌生產工藝實現產品無菌的方法有本質上的差異,從而決定了由這兩類工藝生產的產品應該達到的最低無菌保證水平的巨大差異。最終滅菌無菌產品的無菌保證水平為殘存微生物污染概率≤10-6,非最終滅菌無菌產品的無菌保證水平至少應達到95%置信限下的污染概率<0.1%。由此可見,非最終滅菌無菌產品存在微生物污染的概率遠遠高于最終滅菌無菌產品,為盡量減少非最終滅菌無菌產品污染微生物的概率,鼓勵企業在生產中采用隔離艙等先進技術設備。

                          基于質量源于設計的藥品研發與質量控制的理念,為保證無菌藥品的無菌保證水平符合要求,研發者在產品的研發過程中應根據藥品的特性選擇合適的滅菌方式,并系統地評估生產的各環節及各種因素對無菌保證水平的影響,根據風險的高低與風險發生的可能性等來針對性地驗證滅菌工藝的可靠性,驗證的內容、范圍與批數等取決于工藝與產品的復雜性以及生產企業對類似工藝的經驗多少等因素。只有在研發中經過系統而深入的研究與驗證,獲得可靠的滅菌工藝,并在日常的生產過程中嚴格執行該工藝,才能真正保證每批藥品的無菌保證水平符合預期的要求。當然,在藥品的整個生命周期內,隨著對所生產的藥品的特性和生產工藝等的了解越來越全面和深入,滅菌工藝也在不斷的完善,此時就會涉及到對變更后的工藝如何進行驗證的問題,本指導原則也適用于此種情況。

                          由于滅菌/除菌工藝驗證的工作在我國開展的時間不長,基礎還不牢靠,因此必然在實際工作中會遇到很多難以預料的問題,故本指導原則只是一個一般性原則,藥物研發者應從藥物研發的客觀規律出發,具體問題具體分析,必要時根據實際情況采用其他有效的方法和手段。同時,本指導原則作為階段性產物,必將隨著藥物研究者與評價者對滅菌工藝研究與驗證的認知加深,而不斷進行修訂與完善。

                          2制劑濕熱滅菌工藝

                          2.1濕熱滅菌工藝的研究

                          2.1.1 濕熱滅菌工藝的確定依據

                          滅菌工藝的選擇一般按照滅菌工藝的決策樹(詳見附件1)進行,濕熱滅菌工藝是決策樹中首先考慮的滅菌工藝。濕熱滅菌法是利用高壓飽和蒸汽、過熱水噴淋等手段使微生物菌體中的蛋白質、核酸發生變性而殺滅微生物的方法。高溫在殺滅微生物的同時,可能對藥品的質量也有所影響。如果產品不能耐受濕熱滅菌,則需要考慮采用無菌生產工藝。所以,對于藥品的滅菌工藝的考察和確定,首先是考察其能否采用濕熱滅菌工藝,能否耐受濕熱滅菌的高溫。

                          目前濕熱滅菌方法主要有兩種:過度殺滅法(F0≥12)和殘存概率法(8≤F0<12)。用其它F0值小于8的終端滅菌條件的工藝,則應該按照無菌生產工藝要求。

                          以上兩種濕熱滅菌方法都可以在實際生產中使用,具體選擇哪種滅菌方法,在很大程度上取決于被滅菌產品的熱穩定性。藥物是否能耐受濕熱滅菌工藝的高溫,除了與藥物活性成分的化學性質相關外,還與活性成分存在的環境密切相關,所以在初期的工藝設計過程中需要通過對藥物熱穩定性進行綜合分析,以確定能否采用濕熱滅菌工藝。

                          2.1.1.1活性成分的化學結構特點與穩定性

                          通過對活性成分的化學結構進行分析,可以初步判斷活性成分的穩定性,如果活性成分結構中含有一些對熱不穩定的結構基團,則提示主成分的熱穩定性可能較差。在此基礎之上,還應該通過設計一系列的強制降解試驗對活性成分的穩定性做進一步研究確認,了解活性成分在各種條件下可能發生的降解反應,以便在處方工藝的研究中采取針對性的措施,保障產品能夠采用濕熱滅菌工藝。

                          2.1.1.2 處方工藝的研究

                          在對活性成分的結構特點與穩定性進行研究的基礎上,可以有針對性的進行處方工藝的優化研究。如活性成分易發生氧化反應,則需要考慮是否需要在工藝中去除氧并采取充氮的生產工藝,或在處方中加入適宜的抗氧劑;如活性成分的穩定性與pH值相關,則需要通過研究尋找最利于主成分穩定性的pH值,當然此時需要關注該pH值在臨床治療時能否接受;如果主成分是因為某些雜質的存在影響了穩定性,則需要通過適宜的手段去除相關的雜質;如果是主成分在某種溶劑系統中穩定性較差,則需要考慮更換溶劑系統,此時同樣需要考慮所選用的溶劑系統在臨床應用時能否被接受;濕熱滅菌的不同滅菌溫度和滅菌時間的組合對產品的穩定性的要求有所不同,可以在保證提供所需的SAL的基礎上,通過滅菌時間和滅菌溫度的調整來確定藥物可以耐受的濕熱滅菌工藝。

                          總之,需要通過各個方面的研究,使藥物盡可能的可以采用濕熱滅菌工藝。只有在理論和實踐均證明即使采用了各種可行的技術方法之后,活性成分依然無法耐受濕熱滅菌的工藝時,才能選擇無菌保證水平較低的無菌生產工藝。

                          2. 2.1.3穩定性研究

                          無論使用何種設計方法,都需要進行最終滅菌產品的穩定性研究??疾熳罱K滅菌程序對產品性質穩定性影響的試驗可包括產品的降解、含量、pH值、顏色、緩沖能力以及產品的其它質量特性。

                          滅菌時,殺滅微生物的效果和活性成分的降解都隨著時間和溫度而累積。這意味著加熱和冷卻的變化將影響產品的穩定性,同時影響殺滅效果。因此,穩定性研究用樣品最好選取處于最苛刻的滅菌條件的產品,如:可采用在熱穿透試驗中F0最大的位置上滅菌的產品進行穩定性考察,以確保滅菌產品的質量仍能符合要求。

                          2.1.2過度殺滅法的工藝研究

                          通常來說,與殘存概率法相比,過度滅殺法所需的被滅菌品開始生產階段和日常監控階段生物負荷的信息較少,但是過度殺滅要求的熱能比較大,其后果是被滅菌品降解的可能性增大。

                          過度殺滅法的目標是確保達到一定程度的無菌保證水平,而不管被滅菌產品初始菌的數量及其耐熱性如何。過度殺滅法假設的生物負荷和耐熱性都高于實際數,而大多數微生物的耐熱性都比較低,很少發現自然生成的微生物的D121℃值大于0.5分鐘。因此,過度殺滅的滅菌程序理論上能完全殺滅微生物,從而能提供很高的無菌保證值。由于該方法已經對生物負荷及耐熱性作了最壞的假設,從技術角度看,對被滅菌品進行初始菌監控就沒有多大必要了。

                          但這并不意味著生產過程中對污染可以完全不加控制。僅從控制熱原的角度,也應當遵循工藝衛生規范,控制產品的微生物污染。如果實際生產中能夠嚴格遵循GMP的要求,這一點是可以實現的。

                          2.1.3殘存概率法的工藝研究

                          與過度殺滅法相比,殘存概率法方法所需的信息量要大得多,包括被滅菌品生產開始階段及常規生產階段的信息、指示菌(對滅菌程序呈現強耐熱性的試驗菌)以及生物負荷的信息。只有積累了這類有價值的信息后,才能制定比過度殺滅法F0值低的熱力滅菌程序,同時產品的無菌保證水平不會降低。使用熱力較低滅菌程序更有利于藥品的穩定性,使產品的有效期延長。正是因為這個原因,殘存概率法更適合那些處方耐熱性較差的最終滅菌產品。

                          通常說來,不耐熱藥品的滅菌可能不能使用過度殺滅法,需要設計一個滅菌程序能夠恰當地殺滅生物負荷,同時不導致產品不可接受的降解。這種情況下,滅菌程序的確認就需研究產品的生物負荷和耐熱性。根據以下公式可以比較清楚的說明這一點:

                          無菌保證值= F0 / D - lgN0

                          其中,無菌保證值是SAL的負對數,N0為滅菌開始時產品中的污染微生物總數,D為污染微生物的耐熱參數。所以,菌工藝的無菌保證值與F0、N0、D密切相關。

                          2.1.3.1 滅菌前生物負荷的控制

                          采用殘存概率法進行終端滅菌的產品,除了需要關注滅菌過程本身,還需要在生產過程中采用一些適當的手段來監測和控制藥品滅菌前的生物負荷。具體的措施通常包括滅菌前微生物數量與耐熱性的監測、藥液過濾、工藝參數的控制等等。

                          滅菌前微生物污染水平的監測將在下面的章節詳細闡述。產品過濾在終端滅菌的產品中僅僅作為輔助的控制手段,但是在工藝確定的過程中,也應該對濾膜的孔徑、材質、濾器的使用周期進行必要的篩選。在工藝參數控制方面,由于微生物的特性,通常在藥液放置期間也會逐漸繁殖,尤其一些營養型的注射液,如葡萄糖注射液、復方氨基酸注射液等,其環境更有利于微生物的生長和繁殖,因此應通過工藝篩選和驗證來確定溶液配制至過濾前、以及過濾后至滅菌前能夠放置的最長時限,并相應確定產品的批量、生產周期等關鍵工藝參數。

                          2.1.3.2 滅菌前微生物污染的監測

                          滅菌前微生物污染水平的監測應在正常生產過程中取樣并覆蓋整個生產過程,取樣設計應選取生產過程中污染最大,最有代表性的樣品,且要充分考慮到產品從灌封到滅菌前的放置時間。一般而言,如果灌裝持續一段時間,可從每批產品灌裝開始、中間及結束時分別取樣。污染水平檢查可以采用如下的方法:先用滅菌的5%吐溫充分濕潤0.45um的濾膜,然后定量過濾藥液,將此濾膜移至營養瓊脂平板上,在30~35℃下培養3~7天,計數。

                          分離獲得的污染菌需要進行耐熱性的檢查。污染菌的耐熱性檢查可以采用以下的測定方法:先用滅菌的5%吐溫充分潤濕0.45um 的濾膜,然后過濾污染水平監測所取的藥液樣品,再將此膜移至裝有無菌的待監測產品的試管中,在沸水浴上煮沸約30分鐘,然后在30-35℃下在硫乙醇酸鹽肉湯中培養,觀察是否有耐熱菌生長。

                          當耐熱性檢查發現藥液存在耐熱污染菌污染時,可采用定時煮沸法將它和已知的生物指示劑的耐熱性加以比較,必要時,可再測試耐熱污染菌的D值(D值的具體檢測方法詳見附件2),然后根據滅菌的F0值及污染菌的數量與耐熱性對產品的無菌做出評價。當產品微生物污染水平超標準時,應對污染菌進行鑒別、調查污染菌的來源并采用相應的糾正措施。

                          2.2濕熱滅菌工藝的驗證

                          濕熱滅菌工藝的驗證一般分為物理驗證和生物學驗證兩部分,物理驗證包括熱分布、熱穿透試驗,生物學驗證主要是微生物挑戰試驗。物理驗證是證實滅菌效果的間接方式,而微生物挑戰試驗則直接反映滅菌的效果,兩者不能相互替代。

                          2.2.1物理確認

                          2.2.1.1空載熱分布試驗

                          空載熱分布的目的是主要是了解整個滅菌設備的運行情況,確認滅菌室內的溫度均勻性,測定滅菌腔內不同位置的溫差狀況,確定可能存在的冷點??蛰d熱分布試驗通常采用足夠數量的熱電偶或熱電阻作溫度探頭,進行編號后將它們固定在滅菌柜腔室的不同位置。溫度探頭的安放位置需要根據設備類型和不同位置下的滅菌風險評估而定,應包括可能的高溫點、低溫點,滅菌柜溫度控制探頭處、靠近溫度記錄探頭處,其他的探頭可以均勻地分布于滅菌柜腔室內,以使溫度的檢測具有較好的代表性。溫度探頭在試驗前后至少需要兩個溫度點進行校正。溫度探頭安放結束后,即可以按照設定的滅菌程序進行滅菌。

                          2.2.1.2裝載熱分布試驗

                          裝載熱分布試驗的目的是了解設備在裝載條件下內部的溫度分布狀況,包括高溫點、低溫點的位置,為后續的評估和驗證打下基礎。裝載熱分布一般在空載熱分布的基礎上進行。溫度探頭的個數和安放的位置一般同空載熱分布試驗,注意一定要在空載熱分布試驗確定的冷點安放溫度探頭。溫度探頭安放在待滅菌的容器的周圍,注意不能介入待滅菌的容器。

                          裝載熱分布試驗需要考慮最大、最小和生產過程中典型裝載量情況,進行試驗時,應盡可能使用待滅菌產品,如果采用類似物,應結合產品的熱力學性質等進行適當的風險評估。待滅菌產品的裝載方式和滅菌工藝的各項參數的設定應與正常生產時一致,應采用圖表的方式說明產品的裝載情況,并評估探頭放置是否合理。如果待滅菌產品存在不同包裝規格或濃度規格,應評估驗證所采用的樣品和裝載方式是否能充分反映所有樣品的實際裝載情況。每一裝載量的熱分布試驗需要至少進行三次。溫度探頭在試驗前后同樣均需要進行校正。

                          2.2.1.3 熱穿透試驗

                          熱穿透試驗是考察滅菌柜和滅菌程序對待滅菌產品適用性的一項試驗。熱穿透試驗的目的是確認產品內部也能達到預定的滅菌溫度。對于藥物而言,滅菌程序既要賦予產品一定的F0值,以保障產品的SAL≤10-6 。同時滅菌程序又不應使產品受熱過度而造成藥物部分降解,以致同一滅菌批次的產品出現質量不均一。

                          熱穿透試驗所用的溫度探頭的個數和安放位置需要根據熱分布試驗的結果確定。一般可以采用足夠數量的溫度探頭。應將熱穿透溫度探頭置于液體容器中的冷點,即整個包裝中最難滅菌的位置。如果有數據支持或有證據表明將探頭放在產品包裝之外也能夠反映出產品的熱穿透情況,風險能夠充分得到控制,也可以考慮將探頭放在容器之外。插有溫度探頭的產品的安放位置包括熱分布試驗確定的冷點和高溫點、其他可能的高溫點、滅菌柜溫度探頭附近、溫度記錄探頭處。

                          熱穿透試驗的步驟及要求與裝載的熱分布試驗基本相同,每一裝載方式的熱穿透試驗也需要至少進行三次。通過熱穿透試驗可以確定在設定的滅菌程序下,滅菌柜內各個位置的待滅菌產品是否能夠到達設定的溫度。結合滅菌前微生物污染的檢測,可以確定滅菌柜內各個位置的待滅菌產品是否能夠獲得設定的F0值。

                          對于F0值最大點位置的樣品,由于其受熱情況最為強烈,因此應評估該位置下產品的穩定性情況,以進一步確認滅菌對于產品的穩定性沒有影響。

                          2.2.1.4熱分布和熱穿透試驗數據的分析處理 

                          在物理確認試驗中,應確認關鍵和重要的操作參數并有相應的文件和記錄。通常需要關注的主要參數包括

                          - 每個探頭所測得溫度的變化范圍

                          - 不同探頭之間測得的溫度變化范圍

                          - 探頭測得的溫度與設定溫度之間的差值

                          - 探頭測得超過設定溫度的最短及最長時間

                          - F0 的下限及上限

                          - 滅菌階段結束時的最低F0值

                          - 滅菌階段的最低和最高壓力

                          - 飽和蒸汽溫度和壓力之間的關系

                          - 滅菌階段腔室的最低和最高溫度

                          - 熱穿透溫度探頭之間的最大溫差或F0 的變化范圍

                          - 熱分布試驗中溫度探頭間的最大溫差

                          - 最長平衡時間

                          - 最少正常運行的探頭數

                          合格標準應結合滅菌條件、滅菌設備的特點以及產品的實際情況制定。通常情況下,滅菌柜腔室最冷、最熱點和平均溫度之間的溫差應不超過2.5℃。保溫時間內溫度波動應在±1.0℃之內,如果溫度差別過大,提示滅菌柜的性能不符合要求,需要尋找原因并進行改進,重新進行驗證。另外對于熱敏感的藥物,還應該控制滅菌柜的升溫和降溫時間,以保證熱能的輸入控制在合理的范圍以內,不會對產品的熱穩定性造成影響。

                          2.2.2 生物學確認

                          濕熱滅菌工藝的微生物挑戰試驗是指將一定量已知D值的耐熱孢子(生物指示劑)在設定的濕熱滅菌條件下滅菌,以驗證設定的滅菌工藝是否確實能達到產品所需的標準滅菌時間和F0。此項驗證工作能夠如實反映滅菌工藝條件對微生物的殺滅效果,從而證明該滅菌工藝所賦予相關產品的無菌保證水平是否符合要求。

                          2.2.2.1生物指示劑選用的一般原則

                          一般情況下,生物指示劑選擇的原則性要求是:孢子穩定、非致病菌、易于培養、有效期長、保存及使用方便、安全性好。針對具體的滅菌工藝和具體的產品,還應注意所用的生物指示劑的耐熱性應強于待滅菌產品中的污染菌。

                          濕熱滅菌工藝常用的生物指示劑有以下幾種,嗜熱脂肪芽孢桿菌,枯草芽孢桿菌,凝結芽孢桿菌,梭狀芽孢桿菌等。對于采用過度殺滅法的滅菌程序,生物指示劑系統主要是嗜熱脂肪芽孢桿菌的孢子。殘存概率法由于其熱輸入量比較低,因此在驗證中使用的生物指示劑的耐熱性可以小于嗜熱脂肪芽孢桿菌的孢子。

                          2.2.2.2生物指示劑的使用和放置

                          實際驗證過程中可以直接采用市售的生物指示劑成品或將生物指示劑接種在待滅菌產品上。采用市售品時,只要供應商具有相應的質量體系認證資質,在測試中其提供的生物指示劑的D值就可以被接受。采用將生物指示劑接種到待滅菌產品的方法,由于生物指示劑在不同介質或環境中的耐熱性會有所不同,首先應考慮產品對生物指示劑耐熱性的影響。所以對于具體的品種而言,如果需要將生物指示劑接種至產品之中,應測定生物指示劑在該產品中的耐熱性,即D值。如果生物指示劑與產品不相容,可以用與產品相似的溶液來代替產品。

                          生物指示劑的用量需要根據生物指示劑在待滅菌樣品中的耐熱性來確定,其用量應符合挑戰性試驗的要求。生物指示劑的用量可以采用陰性分數法或者殘存曲線法計算,可以根據實際情況(如污染菌的耐熱性,擬用的生物指示劑的D值等)選擇合適的計算方法,具體檢測方法見附件3。

                          應結合產品特點和熱分布、熱穿透的實際結果來確定生物指示劑的放置位置。裝有生物指示劑的容器應緊挨于裝有測溫探頭的容器,在滅菌設備的冷點處必需放置生物指示劑。滅菌柜的其他部位應裝載產品或者類似物,以盡可能的模仿實際生產時的狀況。

                          2.2.2.3滅菌

                          生物指示劑的驗證應該按照產品設定的滅菌工藝進行滅菌。

                          2.2.2.4檢查和培養

                          可以根據生物指示劑的生長特性以及驗證時的包裝方式,采用適當的方法進行檢查和培養。將指示劑放入培養基中進行培養。需要注意不同的生物指示劑所需要的培養條件也各不相同,針對使用的生物指示劑確定培養條件,同時應放置陰性和陽性對照樣品。

                          2.2.3.5試驗結果的評價

                          根據生物指示劑的D值和接種量推算產品在滅菌過程中實際達到的SAL值。驗證新的滅菌工藝時,每個產品的每個規格的每一滅菌程序,至少需要連續進行三次生物指示劑驗證試驗。如果試驗的重現性好,所有試驗的結果均提示SAL≤10-6,則驗證結果提示該滅菌工藝為驗證合格的滅菌工藝。如果各次驗證的結果不一致,需要分析原因,采取相應的改進措施后重新進行驗證工作。

                          3制劑無菌生產工藝

                          3.1無菌生產工藝的研究

                          無菌藥品應首選采用終端滅菌工藝。如不能耐受終端滅菌工藝條件,應盡量優化處方工藝,以改善其耐熱性。如確實無法耐受終端滅菌工藝,則可采用無菌生產工藝。無菌生產工藝通常包括無菌分裝生產工藝和除菌過濾生產工藝。

                          3.1.1無菌分裝生產工藝的研究

                          無菌分裝生產工藝是將采用經驗證的滅菌/除菌工藝過程處理后的原料藥或者原料藥和輔料,用無菌生產的方法分裝到采用經驗證的滅菌工藝處理的容器中,密封得到的。無菌分裝生產工藝的工藝研究和生產過程控制的重點是影響無菌保證水平的工藝步驟,主要包括物料(包括原料藥、輔料、內包裝材料等)的質量控制、原材料暴露于環境中可能再污染的操作步驟等。

                          關于物料的質量控制,采用無菌分裝生產工藝的制劑所涉及的各種物料,都必須采用適當的滅菌/除菌工藝處理后方可使用。各種物料的滅菌/除菌工藝,都應是經過驗證的、控制良好的工藝。同時需要對各種物料的無菌性、細菌內毒素水平等進行嚴格控制,通過研究確定相應的質控標準。

                          無菌分裝的生產工藝是將原料藥或者原料藥和輔料經分裝設備分裝至內包裝材料中后密封得到。分裝步驟是影響產品質量和無菌保證水平的關鍵生產步驟,應結合生產設備和產品特點進行工藝參數的研究,包括分裝速度和分裝時間等。

                          無菌分裝生產工藝能否達到設定的無菌保證水平,與整個生產過程的控制密切相關,應按照GMP要求及產品具體生產工藝情況進行生產環境和生產過程的控制。在進行無菌生產工藝驗證時,應采用最差條件進行驗證,在實際生產過程中,對生產過程和工藝參數的控制均不能超過經驗證的最差條件的控制范圍。

                          3.1.2 過濾除菌生產工藝的研究

                          過濾除菌的無菌生產工藝是通過除菌過濾器,將藥液中的微生物除去得到無菌濾液。采用過濾除菌工藝時,同樣需要對影響無菌保證水平的工藝步驟及工藝參數進行詳細的研究,主要包括物料的質量控制、除菌過濾器的選擇及除菌過濾工藝參數的研究、除菌過濾生產過程的控制等。

                          對于采用過濾除菌生產工藝的制劑,需注意對配制藥液使用的原料藥、輔料(包括注射用水)等原材料的微生物種類及數量進行檢查,掌握潛在的污染微生物的總體特性情況,通過研究確定相應的質控標準。采用過濾除菌生產工藝的制劑所使用的內包裝材料,必須采用適當的經驗證的滅菌工藝處理后方可使用。

                          除菌過濾生產工藝所使用的除菌過濾器,通常為標稱孔徑0.2微米或更小的除菌級的過濾器。除菌過濾器的過濾效能是評價除菌過濾工藝的重要參數,需要對除菌過濾器的過濾效能進行驗證。通常,影響除菌過濾器的除菌過濾效能的因素包括:①藥液的性質,如藥液的粘度、表面張力、pH值、滲透壓等;② 過濾步驟的工藝參數,如過濾的壓力、流速、時間、溫度等;③ 除菌過濾器的相關參數,如除菌過濾器與藥液的相容性、除菌過濾器的過濾總量和使用周期等。除菌過濾器的過濾效能可因產品和操作條件不同而顯著不同。除菌過濾器的選擇及工藝參數的研究可結合上述影響除菌過濾器的過濾效能的因素進行。在實際生產過程中,在過濾除菌前后均需要進行濾器完整性測試。由于微生物通過過濾器的概率隨著待過濾溶液中微生物數量的增加而增加,除菌過濾工藝中需對待過濾溶液的微生物負荷情況進行研究和控制,通常情況下,最終除菌過濾前,料液的微生物負荷應不超過10cfu/100ml。應通過研究確定無菌生產各操作環節的時間控制范圍,如料液配制后待過濾的存放時間、藥液過濾操作的時間、過濾后至灌裝前放置的時間、灌封操作的時間、滅菌后的內包裝材料及密封件允許的放置時間等。各生產環節操作時間的確定需提供相應的試驗數據。

                          3.2 無菌生產工藝的驗證

                          無菌生產工藝的驗證主要包括培養基模擬灌裝試驗,應當盡可能模擬常規的無菌生產工藝,包括所有對無菌結果有影響的關鍵操作,及生產中可能出現的各種干預和最差條件。新建的無菌生產工藝的生產線在正式投產前必須進行連續三批無菌培養基模擬灌裝試驗。在生產用的設備、設施、人員結構及工藝方法有重大變更時都應進行培養基模擬灌裝試驗。實際生產中每半年應至少進行一次培養基模擬灌裝試驗。

                          對于除菌過濾無菌生產工藝的驗證,還包括對除菌過濾系統的驗證,如過濾器的微生物截留驗證、過濾器與待過濾藥液的相容性驗證、過濾器的完整性驗證等。

                          3.2.1培養基模擬灌裝試驗

                          3.2.1.1培養基

                          培養基模擬灌裝試驗需要選擇合適的培養基,并對培養基的質量進行控制。

                          應當根據產品的劑型、培養基的選擇性、澄清度、濃度和滅菌的適用性選擇培養基。一般選用胰胨大豆肉湯培養基(TSB),按每30g1L過濾純化水的比例,配制足夠量。某些特殊情況下也可以選用厭氧生長培養基,如硫乙醇酸鹽培養基(FTM)。

                          培養基的質量控制主要包括培養基的微生物生長性能和無菌性。

                          培養基的微生物生長性能:在按照標準操作規程制備培養基并滅菌后,可按照中國藥典附錄進行培養基微生物生長性能試驗,確認所制備的培養基應出現明顯的所接種的微生物的生長。

                          培養基的無菌性:可按照中國藥典附錄進行培養基無菌性檢查,結果應符合規定。

                          在培養基模擬灌裝試驗中,需進行陽性對照試驗,即取低濃度的菌種接種于進行陽性試驗用的對照容器中,與培養基模擬灌裝試驗在同一條件下進行培養。除了中國藥典附錄中規定的陽性菌,建議使用生產環境中常見的微生物,如枯草芽孢桿菌、白色念珠球菌,或者在同一生產環境中曾被檢出過的菌種。接種量一般每個容器102以下,每個菌種接種2瓶,通常需均證實有菌生長,該培養基模擬灌裝試驗方有效。

                          如果試驗中需要使用模擬分裝用粉末,同樣需要對模擬分裝用粉末進行選擇和質量控制。模擬分裝用粉末的選擇一般遵循以下原則:①可以在干粉狀態下滅菌,滅菌后的無菌性達到藥典規定的標準;②流動性較好,可以用分裝機分裝;③可溶于液體培養基;④在模擬試驗應用的濃度下無抑菌性。常用的模擬分裝材料有乳糖、甘露醇、PEG6000、PEG8000等,也可以采用培養基干粉作為模擬分裝用無菌粉末。

                          3.2.1.2模擬無菌生產工藝的操作過程

                          培養基模擬灌裝試驗中使用的內包裝材料的清洗、滅菌,分裝設備的清洗、消毒及與產品接觸的分裝設備部件的清洗、滅菌、安裝過程均應遵循與實際生產操作相同的標準操作規程。培養基模擬灌裝試驗過程中應制訂取樣計劃,對使用的內包裝材料間隔一定數量后隨機取樣進行無菌性檢查;同時,全部與產品接觸的設備表面應無菌。某些特殊情況下,如膠塞具有抑菌性,則需要考慮更換采用其他相當的但無抑菌性的膠塞。

                          應當注意有足夠數量的培養基與容器的內表面充分接觸,灌裝培養基時,每個容器的灌裝體積一般為1/3-1/2之間,最多不能超過容器的85%。應注意,對于凍干粉針劑的驗證試驗,在培養基灌裝半壓塞后,只需模擬樣品進入和移出凍干機的過程即可,而不必模擬凍干過程,以保證一旦有細菌,能夠保持較好的生存能力。同時,還應模擬一些可能造成污染的操作步驟,如抽真空,充氮等步驟。

                          培養基模擬灌裝試驗應當盡可能模擬常規的無菌生產工藝,應當包括所有對無菌結果有影響的關鍵操作,包括生產中可能出現的各種干預和最差條件,各種干預和最差條件的考慮需要體現風險控制的理念。通??赡艹霈F的各種干預和最差條件包括:①人員數量和他們的活動、換班、休息、更衣(需要時);②設備調試,正常停車、非正常停車、意外事故(如檢修等);③采用滅菌后所允許放置的最長時間的設備或者車間進行生產;④模擬生產時間最長的批量所需的時間;⑤采用最慢的填充速度和最大的包裝容器(即最長的暴露時間);采用最快的填充速度和最小的包裝容器(即容易伴隨更多干預的生產情況)??傊?,在試驗計劃中,總體研究設計和運行時間應該模擬可能出現的各種干預和最差操作條件,覆蓋所有實際生產過程涉及的操作。

                          培養基模擬灌裝的數量應當足以保證評價的有效性,批量較小的產品,培養基模擬灌裝的數量應當至少等于產品的批量。

                          3.2.1.3試驗結果的評價

                          培養基模擬灌裝試驗需要對所有灌裝樣品進行培養和無菌檢查。培養基模擬灌裝試驗的目標是零污染,應當符合以下要求:

                          灌裝數量

                          允許的污染數量

                          少于5000支時

                          不得檢出污染品

                          500010000支時

                          1支污染,需調查,可考慮重復試驗;

                          2支污染,需調查后,進行再驗證

                          超過10000支時

                          1支污染,需調查;

                          2支污染,需調查后,進行再驗證

                          一旦發現污染,需要進行偏差調查,包括污染菌的鑒別、污染情況的評估、是否可以重復進行試驗等等。

                          3.2.2 除菌過濾系統的驗證

                          除菌過濾系統的驗證一般包括:微生物截留研究、析出物研究、化學兼容性研究和藥液吸附研究。

                          3.2.2.1微生物截留研究

                          過濾器的微生物截留驗證的目的:除菌過濾器微生物截留試驗是通過模擬實際過濾工藝,過濾含有一定量生物指示菌的溶液,確認除菌過濾器的微生物截留能力。

                          過濾器的微生物截留驗證的設計:

                          1)挑戰用微生物的選擇

                          通常采用缺陷性假單胞菌作為挑戰性試驗用菌。在有些情況下,缺陷性假單胞菌可能不能代表最壞條件,則需要考慮采用其他細菌。如果使用其他細菌,應保證該細菌足夠細小至足以挑戰除菌級別濾器的截留性能,并能模擬產品中發現的最小微生物。應盡可能的進行微生物負荷的鑒別和量化研究,掌握所分離的微生物的形態學特征,為挑戰性微生物的選擇提供依據。

                          挑戰性微生物的大小可以通過其可穿過0.45微米級別的濾膜來確證。通常情況下,標準培養條件下生長的缺陷性假單胞菌,在高挑戰濃度(如≧107)時,能少量穿過0.45微米級別的濾膜。

                          2微生物截留試驗條件

                          在試驗室模擬生產工藝條件,將定量缺陷性假單胞菌加入到料液中,進行過濾。根據實際生產條件,考慮確定微生物截留試驗的過濾時間及溫度、壓差、流速等。建議對實際生產的過濾工藝進行一次徹底評估,包括溶劑性質(例如水性的、酸、堿、有機的)、過濾時間、工藝壓差、工藝流速、工藝溫度和過濾器設計規范,以便合理設計微生物截留試驗條件。

                          過濾時間和壓差會影響細菌截留試驗的結果。在完整的生產時間進行微生物截留試驗可以對那些與時間有關的因素進行評估,如過濾器兼容性,完整性的維持,時間依賴性的穿透等。

                          微生物截留試驗過程中的壓差應達到或超過實際生產過程的最大壓差和/或最大流速(在過濾器制造商的設計規范內)。在驗證過程中同時模擬壓差和流速可能是不可能的。在設計挑戰試驗條件時過濾器的使用者應該確認哪個參數與特定工藝的相關性更高,以便為微生物截留試驗條件的確定提供依據。

                          微生物截留驗證研究應包括多個批次的濾膜(通常三個批次)。在用于微生物截留驗證研究的三個批次的濾膜中,至少應有一個批次是進行預研究時或使用前物理完整性測試時的數值通過但是接近(例如,10%之內)過濾器生產商提供的合格規范限值的。

                          3)微生物截留驗證研究中使用的過濾膜的物理完整性檢測數值應包括在實驗報告中。物理完整性檢測應使用已有規范值的水、產品或其它潤濕流體來進行測試,并在進行微生物挑戰前完成。

                          如果微生物截留驗證研究后,測試用微生物在任何過濾器的下游被檢測到,那么就需要對此進行調查。如果調查確認測試用微生物能穿透完整性檢測達標的過濾器,那么就應重新考慮此種過濾器在這些工作條件下的適用性。

                          需要關注的是,過濾器的重復使用通常是不被推薦的。如果需要重復使用除菌級過濾器,需要說明理由,重復使用的相關參數(如過濾量等)也需要經過嚴格的驗證后確定相應的范圍。

                          3.2.2.2析出物和釋放物研究

                          析出物指在人為或挑戰性條件(如溶劑、溫度或時間)下,從某一材料中脫離的任何化學組分。釋放物是指在正常儲存或使用條件下,從接觸面上進入產品或工藝流體中的物質。潛在的析出物或釋放物的來源包括但不限于:膜組件(如:成形劑、表面活性劑、抗氧化劑、殘留溶劑、支架層)和塑料組件(如:封蓋、外殼、支架、O型圈)。影響釋放物的因素可能包括過濾液的化學性質、滅菌方法、接觸時間、溫度和過濾量與面積之比。有機溶液的過濾產生的釋放物可能比水溶液過濾要更高。

                          析出物數據可從過濾器生產商處獲得,也可以由過濾器使用者進行試驗取得??紤]到析出物的來源不同和影響析出物的因素較多,建議過濾器使用者在開展研究時盡可能使用實際產品,并使用與實際生產相同類型的過濾器。有些情況下可能需使用替代溶液進行試驗,例如,產品會干擾分析方法或產品有抑菌性等。這時,替代溶液必須與待過濾產品性質盡可能一致。另外,也可以選擇使用幾種溶液來涵蓋實際過濾溶液的pH、離子強度或有機成分的含量等特性。如果使用了替代溶液或幾種溶液合并的方式,則必須提供溶液選擇的合理依據。

                          一旦確定好用于析出試驗的萃取溶液(產品、替代液或幾類溶液合并使用),則應在設計試驗時模擬實際生產條件下最劣工況,具體應考慮諸如溫度、時間、pH和預處理(如:沖洗、滅菌)工序等關鍵變量。析出試驗應采用過濾裝置處于最劣生產條件時的接觸時間和溫度,使用經過高壓滅菌或消毒過的過濾器來完成??梢杂渺o態浸泡或循環流動的方法。采用靜態浸泡法時,過濾器在給定溫度的析出溶液中浸泡一段既定的時間。而采用循環流動法時,萃取液在既定的時間內循環反復穿越過濾器。將萃取液收集并檢測,從而確定其中的過濾器析出物。

                          在取得過濾器萃取液后,通過分析可以確定來自過濾器的物質種類和含量。除了對過濾器析出物的種類和含量進行確定外,必要時還可以采用已被認可的生物反應性試驗對其安全性進行評估。

                          3.2.2.3 相容性研究

                          過濾器的相容性研究用來評估過濾裝置與料液的化學相容性,以避免可能的過濾器受損或變形,并能防止料液受到釋放物或微粒物質的污染?;瘜W相容性試驗應涵蓋整個裝置,試驗的設計應考慮料液性質、過濾溫度和接觸時間等。由于過濾裝置與過濾料液或溶劑之間可能存在諸多化學相互作用,過濾器生產商所提供的代表性的化學相容性表通常只作為過濾器使用者的參考,過濾器使用者需要進行更全面的測試。通常的化學相容性試驗包括:接觸料液前后的目視檢查、過濾過程中流速變化、濾膜重量變化、過濾前后起泡點變化等。

                          3.2.2.4 吸附性研究

                          吸附是所過濾的料液中的某些成分粘附在濾膜上的過程,可能影響料液的構成和濃度。過濾器中吸附性的材料包括濾膜、硬件和支撐性材料。吸附試驗條件可以根據實際生產條件確定,流速、過濾時間、料液濃度、防腐劑濃度、溫度和pH值等因素都可能影響吸附效果。吸附試驗中采用的檢測方法可以采用產品質量標準中所確定的相關檢測方法。

                          4原料藥無菌生產工藝

                          無菌原料藥是指在法定的藥品標準中規定無菌檢查項目的原料藥?;瘜W原料藥的常用生產工藝包括化學合成工藝、微生物發酵工藝,以及采用微生物發酵產品作為起始原料的半合成工藝;而原料藥的無菌工藝特指對制成的原料藥進行無菌化處理的相關工藝,無菌工藝之前的生產過程不屬本章節的討論范疇。但對于用于無菌制劑生產的無菌輔料(如鹽酸精氨酸、碳酸氫鈉等)的無菌工藝驗證也可以參考本指導原則的相關要求。

                          與無菌制劑工藝相比,無菌原料藥的生產工藝一般要更復雜,設備類型多種多樣,且不同的工藝有不同的特點。工藝過程中的物料、內包裝材料、設備(包括閥門、管道等相關部件)的滅菌和無菌傳遞、對接、組裝等操作相比無菌制劑要復雜的多。原料藥從非無菌轉化成無菌狀態的常用方法是通過除菌過濾來實現。該過程受料液性質影響很大,需要根據料液的性質選擇適當的過濾器及濾芯的材質。另外,原料藥的生產設備通常體積較大且內部結構復雜,在選擇放置位置或進行投料、取樣、回收操作時應考慮如何保證潔凈區內的氣流流向符合要求,以及如何匹配好高效過濾器的位置與設備本體之間的位置分布等等。

                          盡管無菌制劑和無菌原料藥在生產過程和質量控制特點上存在諸多不同,但就無菌保證的基本原則,以及生產管理和驗證的基本原則而言,兩者的要求又是相通的。因此在生產設備、廠房設施、潔凈級別及監測、滅菌工藝與方法及質量控制要求等方面,無菌原料藥和無菌制劑的要求可以相互參考。

                          4.1 無菌原料藥生產工藝特點

                          無菌原料藥可以通過最終滅菌或非最終滅菌的方式獲得。對于采用最終滅菌的無菌原料藥,必須嚴格控制微生物污染、細菌內毒素和不溶性微粒的水平。由于多數原料藥的耐熱性較差,所以通常無菌原料藥采用非終端滅菌的方式生產。

                          無菌原料的精制過程和除菌過程經常結合在一起,作為生產工藝的一個單元操作來完成。目前生產上最常用的方法是無菌過濾法;即將非無菌的中間體或原材料配制成溶液,再通過0.22μm孔徑的過濾器以達到除去細菌的目的。無菌原料藥常用工藝包括溶媒結晶和冷凍干燥兩種,前期國內也有采用噴霧干燥工藝的無菌原料藥,但是多因為其生產工藝不能滿足無菌工藝的驗證要求而逐漸被放棄或進行了工藝變更。

                          溶媒結晶工藝和冷凍干燥工藝涉及的具體設備和操作各不相同,但都采用除菌過濾的方式使料液從非無菌狀態轉變為無菌狀態,并且要在此后的干燥、粉碎、混合以及分裝過程中始終保持無菌狀態。

                          4.1.1 溶媒結晶工藝

                          典型的溶媒結晶工藝流程包括非無菌原料藥的溶解、除菌過濾、結晶、固液分離(如常用過濾、離心等方法)、洗滌、干燥、粉碎、混合、分裝等過程。溶解環節應關注物料的微生物負荷、溶劑的質量、設備的微生物污染水平以及使用的料液輸送動力源(如空氣或氮氣)的微生物污染水平。除菌過濾環節應關注濾器本身的無菌性、過濾器與料液的相容性、濾芯本身及裝配后的完整性、過濾器的清洗及滅菌周期、過濾器的除菌效率、除菌濾器前料液的微生物污染水平等。結晶環節應關注設備無菌性、密封性及密封裝置的可靠性、設備的清洗及滅菌周期、呼吸器的完整性及無菌性;如需加入晶種,晶種本身應符合無菌藥品的要求,并且應驗證晶種加入過程的無菌保證。過濾或離心環節應關注設備無菌性、密封性能及密封裝置的可靠性、清洗及滅菌周期、呼吸器的完整性及無菌性等。洗滌環節應關注洗滌溶劑的無菌性。干燥環節應關注干燥設備無菌性、密封性能及密封裝置的可靠性、清洗及滅菌周期、呼吸器的完整性及無菌性,以及真空系統的防倒吸設置(如使用真空,應在管路上安裝除菌級別的過濾器)。粉碎環節應關注設備無菌性、密封性能及密封裝置的可靠性;粉碎用氣體(如使用氣流粉碎機)的無菌保證、給料方式的無菌保證水平等?;旌檄h節應關注設備無菌性、密封性能及密封裝置的可靠性、清洗及滅菌周期等。分裝環節應關注分裝設備本身的無菌性或者其產品暴露潔凈級別是否達到A級區標準,關注內包裝材料的無菌性、內包裝材料的遞入方式、內包裝容器的密封性以及取樣環節的無菌保證。

                          4.1.2 冷凍干燥工藝

                          凍干無菌原料藥的典型流程包括原料藥的溶解、除菌過濾、冷凍干燥、粉碎、混合和分裝。其中除冷凍干燥環節外,其它工藝步驟的關注重點可參考溶媒結晶工藝的相關要求。凍干工藝環節中應關注的主要問題包括凍干機本身及附屬裝置的無菌性、密封性能及密封裝置的可靠性、清洗及滅菌周期、設備的可清洗及可滅菌性;真空系統的保證及干燥后的壓力平衡,補氣過程的無菌保證(宜補充無菌氣體或者在凍干機上安裝除菌呼吸過濾器),以及物料進出設備時的無菌保證。

                          4.2 無菌原料藥工藝驗證

                          采用終端滅菌工藝的無菌原料藥工藝驗證可參考制劑終端滅菌工藝驗證的相關要求。非終端滅菌的無菌原料藥工藝驗證主要包括培養基模擬灌裝驗證和過濾除菌系統驗證。其中的過濾除菌系統驗證可參考無菌制劑的相關要求,并重點關注進入結晶罐的所有物料(如原料藥、溶媒、酸堿、氣體等)均應除菌過濾,并進行相關驗證。

                          4.2.1 驗證批量

                          常規生產批量較小的無菌原料藥,應最大限度模擬大生產的批量。對于常規生產批量較大的無菌原料藥,考慮到模擬大生產批量的可行性和實際介質培養的可行性,模擬灌裝批量可以比大生產批量小,但模擬介質應能夠接觸到所有產品可能接觸的設備內表面。并能夠充分模擬實際生產可能遇到的其它各種最差條件。

                          4.2.2 最差條件

                          選擇最差條件時,應考慮進出人數(包括維修人員)、生產材料、設備設施在無菌區的暴露時間、設備滅菌后至開始灌裝前的間隔時間,以及微生物抑制因素(如溫度、氮保護、抗生素)的調整和消除等。應確認模擬介質是否能接觸到實際生產工藝過程中所有無菌產品可能接觸到的表面,時間間隔是否具有可比性(比如溶解過濾時間應不短于實際生產過程中使用的時間),可將時間延長來模擬最差條件,如果縮短時間來模擬,需要說明/論證是否縮短時間后的條件可等同于生產工藝的最差條件。

                          其它要求可參考無菌制劑的驗證相關內容。


                          附件1滅菌工藝選擇的決策樹

                          溶液劑型產品滅菌方法選擇的決策樹


                          附件2:D值的測定方法

                          一般可以采用毛細管暴熱計時法測定污染微生物的耐熱參數D值,測定主要包括以下幾個步驟:

                          ①制樣:將產品中的微生物分離,將菌膜或者孢子懸浮液分別放入注射用水或者磷酸鹽緩沖液中,采用適宜的設備振動使其分散均勻,制備成濃度約為108個/ml的懸浮液,然后在沸水中加熱約10分鐘以殺滅可能存在的芽孢繁殖體。

                          ②測定:將上述懸浮液注入適宜長度的毛細管中,使每管的菌量為106個孢子,封口,置于校正過的121℃的油浴中曝熱。每隔1-3分鐘取出兩支毛細管并迅速冷卻,制備孢子溶液,培養后計數。

                          ③計算:根據公式lgNt=lgN0-t/D ,其中,N0和Nt分別為零時和曝熱t 時間的孢子的濃度。

                          由以上的D值的測定方法可知,測定所需的儀器并不非常復雜,但需要專業技術人員和經驗的積累。在不具備D值測定條件時,可以采用測定污染菌的耐熱性來代替。

                          附件3:生物指示劑用量的確定方法。

                          ① 陰性分數法

                          根據公式:

                          F0=L×t,其中L為滅菌溫度的滅菌率(Z=10),t為滅菌時間。

                          SLR=FO/Dbi  ,其中SLR為spore log reduction,即孢子對數下降值,Dbi為所選用的生物指示劑的D值。

                          SLR=lgNO- lgNt  ,其中NO為滅菌前容器內初始孢子數,Nt為滅菌后容器內殘存孢子數。

                          lgNt=2.303×lg(n/q) ,其中n為挑戰性試驗瓶樣品總數,q為挑戰性試驗結果為陰性的瓶數)

                          可以得到:

                          lgNO  =lgNt +SLR= 2.303×lg(n/q) + FO/Dbi  =2.303×lg(n/q) + L×t /Dbi

                          當濕熱滅菌工藝的滅菌溫度和滅菌時間確定后,L、t可以確定;生物指示劑確定后,Dbi可以確定;微生物挑戰試驗方案確定后,n、q可以確定。所以,通過以上的幾個公式,可以計算出生物指示劑的用量,即NO。

                          需要說明的是,在常規的生產條件下,如采用115℃滅菌30分鐘,假定采用的生物指示劑的D值為1,那么,計算得到的生物指示劑的用量為106,這也是微生物挑戰試驗時常規采用的用量。

                          ② 殘存曲線法

                          根據公式:

                          FT/Dbi = lgNO  +1,其中FT 為T滅菌值,即給定Z(Z=10)值下,滅菌程序在溫度T下的等效滅菌時間,FT= F0/L;Dbi為所選用的生物指示劑的D值;NO為滅菌前容器內初始孢子數。

                          當濕熱滅菌工藝的滅菌溫度確定后,L可以確定;生物指示劑確定后,Dbi可以確定;當F0設定后,即可計算出生物指示劑的用量,即NO。

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